Laboratorio di trombosi e microangiopatie trombotiche

Diagnostica

Il laboratorio si occupa della diagnosi di microangiopatie trombotiche, con particolare riferimento alla porpora trombotica trombocitopenica, dosando le proteine coinvolte dal punto di vista sia antigenico (quantità proteina circolante) che funzionale. Inoltre vengono dosati anticorpi contro tali proteine.

Il laboratorio contribuisce alla standardizzazione e ai controlli di qualità per i test di base.

Ricerca

Studi epidemiologici e naturalistici riguardanti la porpora trombotica trombocitopenica

Poiché la porpora trombotica trombocitopenica è una malattia rara, i registri di malattia rappresentano uno strumento efficace per rispondere ai quesiti ad oggi ancora insoluti attraverso la raccolta, l’organizzazione e l’accurata analisi statistica di un numero più ampio possibile di dati di pazienti affetti. Gli studi in corso si occupano di valutare mortalità, comorbidità, rischio di complicanze, fattori di rischio genetici e ambientali, efficacia del trattamento e gli aspetti farmaco-economici.

A tale scopo abbiamo sviluppato un database internazionale TTP, che contiene informazioni cliniche, laboratoristiche, genetiche e terapeutiche di pazienti provenienti da diversi paesi del mondo. Maggiori informazioni sono disponibili sul sito: Thrombotic Thrombocytopenic Purpura Database

Caratterizzazione delle mutazioni a carico del gene ADAMTS13

Oltre che per la diagnosi, l’identificazione di mutazioni e lo studio del loro effetto funzionale sono importanti poiché rappresentano dei modelli che si presentano in natura e possono fornire informazioni sulla relazione struttura-funzione della metalloproteasi ADAMTS13 e sulla sua interazione con il fattore di von Willebrand.

Approfondimento della fisiopatogenesi della porpora trombotica trombocitopenica

Questi studi avvengono attraverso l’analisi delle proprietà funzionali degli anticorpi anti-ADAMTS13 e degli immunocomplessi circolanti, del ruolo del sistema del complemento, mediante la valutazione della de-regolazione della risposta immunitaria cellulare e la ricerca di nuovi marker associati alla patologia attraverso l’applicazione di nuove tecniche di proteomica e di sequenziamento e genotipizzazione di acidi nucleici.

Ruolo di ADAMTS13 nella trombosi macrovascolare ed in altre patologie

Le competenze, conoscenze e tecnologie acquisite nell’ambito delle microangiopatie trombotiche vengono applicate allo studio del ruolo di ADAMTS13 in altre patologie trombotiche e infiammatorie, quali ad esempio la trombosi venosa profonda, la cirrosi e le malattie infiammatorie intestinali (IBD).

Sviluppo e validazione di nuovi metodi di laboratorio

Il laboratorio valida nuove metodiche per il dosaggio di ADAMTS13 e del suo anticorpo sviluppate sia in proprio che esternamente. I risultati di questi studi hanno un duplice impatto di ricerca e di diagnostica, consentendo di confrontare le metodiche nuove e preesistenti, e di individuare nuovi marcatori diagnostici e prognostici di malattia.

Fattori di rischio genetici in pazienti con trombosi venosa

Il laboratorio si dedica all’individuazione di nuovi fattori di rischio genetici in pazienti con trombosi venosa profonda, trombosi dei seni venosi cerebrali, trombosi venose splancniche mediante sequenziamento di nuova generazione (next-generation sequencing, NGS).

Test disponibili

  • Valutazione dell’attività funzionale di ADAMTS13 mediante FRET-VWF73 e test immunoenzimatici commerciali
  • Valutazione del livello antigenico di ADAMTS13 mediante test immunoenzimatico ELISA
  • Valutazione della presenza di autoanticorpo anti-ADAMTS13 mediante Western blotting e test immunoenzimatico ELISA
  • Valutazione dell’attività neutralizzante dell’autoanticorpo anti-ADAMTS13 mediante metodo di Bethesda e successiva misurazione dell’attività funzionale residua di ADAMTS13
  • Valutazione della presenza di immunocomplessi circolanti anti-ADAMTS13 mediante test immunoenzimatico ELISA e immunoprecipitazione seguita da western blotting
  • Valutazione del pattern multimerico di VWF
  • Estrazione di DNA da sangue intero
  • Amplificazione e sequenziamento diretto del gene ADAMTS13
  • Ricerca di ampie delezioni o duplicazioni mediante MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe)
  • Next-generation sequencing: whole-genome, exome, sequenziamento mirato dei geni della coagulazione
  • Produzione di plasmidi di clonaggio e d’espressione
  • Produzione e purificazione di proteine ricombinanti mediante cromatografia
  • Tecniche di colture cellulari: allestimento ed espansione di colture cellulari primarie e di linea e loro stoccaggio, trasfezione di acidi nucleici, immunoprecipitazione, pulse-chase, immunofluorescenza.